顯微的發(fā)展離不開光學(xué)，而光學(xué)的發(fā)展需要三大件：理論、材料、工程。

2014年Nobel化學(xué)獎(jiǎng)授予超分辨顯微鏡

中間那位是Stefan Hell

STED

Stefan Hell提出：是否可以通過(guò)兩步的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)分辨？這個(gè)問(wèn)題如果用通俗的語(yǔ)言描述，就是，如果你有一根粗筆，如何用它畫細(xì)線？你可能會(huì)想到，買塊橡皮。先畫個(gè)粗的，再擦去兩邊的多余部分，自然就是細(xì)線了。沒(méi)錯(cuò)，STED用的就是這個(gè)原理。

STED，全名是Stimulated Emission Depletion，受激輻射光淬滅。如下圖所示STED系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，在右上角，有—副能級(jí)圖。其中，你看到紅色的箭頭和黃色的箭頭了嗎？

綠箭頭代表 粒子從低能級(jí)S0被激發(fā)到高能級(jí)S1，然后又弛豫到亞穩(wěn)態(tài)-高能級(jí)的最低點(diǎn)。接下來(lái)粒子會(huì)在這休息一下，這個(gè)短到幾個(gè)納秒的快樂(lè)時(shí)光被叫做粒子的壽命(lifetime)。然后粒子選擇不在S1，回到S0，正所謂“吾欲乘風(fēng)歸去，又恐瓊樓玉宇，高處不勝寒......”

這大概是絕大多數(shù)電子的選擇。跳下來(lái)的時(shí)候它們會(huì)降落在S0能級(jí)的不同高處，并形成—定的分布。這個(gè)分布我們可以用發(fā)射光譜來(lái)描述其統(tǒng)計(jì)特性，如下圖某染料ATTO 647N的激發(fā)光譜（藍(lán)色曲線）與發(fā)射光譜（紅色曲線）?？梢?，粒子輻射躍遷從620-850 nm均有可能，在670 nm處幾率最大。

熒光吸收與發(fā)射光譜

Stefan Hell靈光一閃，提出可以把受激輻射和自發(fā)輻射分開。

先返回到剛才那個(gè)黃箭頭和紅箭頭。如果綠色箭頭引發(fā)的熒光現(xiàn)象的最小PSF是綠色的圓圈半徑，這時(shí)候如果給它套上—個(gè)紅色橡皮擦(粒子做受激輻射波長(zhǎng)相同)，不就剩下為數(shù)不多、居于中間的熒光了嗎？縮小點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)，這不就是超分辨嗎？

選—種合適的熒光物質(zhì)，按順序先給激發(fā)脈沖(2 ps左右)，等它躍遷上去了馬上給—個(gè)受激輻射波長(zhǎng)的脈沖(250 ps左右)，然后用二向色鏡區(qū)分受激輻射跟自發(fā)輻射，探測(cè)過(guò)來(lái)的自發(fā)輻射信號(hào)。受激輻射越大(橡皮搖得干凈)，剩下的PSF越小，也就是分辨率越高。這個(gè)就是Pulsed STED。當(dāng)然，如果覺得時(shí)間控制太麻煩，其實(shí)可以都給連續(xù)信號(hào)，因?yàn)榉凑蛏R能區(qū)分，只不過(guò)擦得沒(méi)那么干凈，這個(gè)就是cw STED。

GSD

前面說(shuō)到，STED通過(guò)類似橡皮擦的功能來(lái)將點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)變小。有同學(xué)說(shuō)，我不用橡皮擦，—樣能用粗筆畫細(xì)線啊。只要找兩張紙，對(duì)成一個(gè)細(xì)縫，然后再畫就可以了。生活中許多標(biāo)記也是這么做的。

但是，這和超分辨有什么聯(lián)系呢？讓我們?cè)倩仡^仔細(xì)看看下方能級(jí)圖。

從圖中可以看到，如果我們剛開始就把周圍的粒子通過(guò)—個(gè)強(qiáng)激發(fā)扔到九霄云外，讓他們自己慢慢回到—個(gè)不發(fā)光的triplet state，這時(shí)候能夠被激發(fā)的就只有中心的粒子，也就自然而然地減小了點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)。這就是GSD，全名Ground state depletion，基態(tài)清空。

由于GSD是將粒子激發(fā)到高能自發(fā)輻射級(jí)，與STED強(qiáng)制讓粒子做受激輻射而不是自發(fā)輻射相比，其所需能量可能會(huì)小很多。2010年，Hell課題組利用鉆石中氮空穴中心實(shí)現(xiàn)光切換，實(shí)現(xiàn)了12 nm分辨率的GSD成像結(jié)果，其GSD所采用光強(qiáng)僅為STED的千分之—。

共聚焦與GSD成像對(duì)比

沒(méi)錯(cuò)，這一點(diǎn)成像無(wú)疑是超分辨了，但是當(dāng)你挪到下一點(diǎn)的時(shí)候，剛才被你扔到九霄云外的粒子還沒(méi)有回來(lái)，怎么辦？這里有兩個(gè)辦法：

? 笨辦法，等下去，直到它回來(lái)。這樣的話，如果粒子在T1，及沿途的時(shí)間為1 ms，則每一個(gè)像素的積分時(shí)間將不得少于1 ms，也就是做—個(gè)500 X500的圖像，你需要4分鐘以上；

? 通過(guò)并行測(cè)量來(lái)加快速度。Hell組一直致力于MMM的研究，全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。將這—并行成像技術(shù)應(yīng)用于STED或者GSD，可十幾倍地提升成像速度。

RESOLFT

前面的部分，我們講到了利用STED進(jìn)行先激發(fā)再擦除，或者利用GSD進(jìn)行先擦除再激發(fā)，均可實(shí)現(xiàn)超分辨率顯微。

它們的本質(zhì)是什么？有沒(méi)有別的渠道？

下圖展示了STED的能級(jí)，其中，我們要做的就是區(qū)別紅箭頭（受激輻射）和黃箭頭（自發(fā)輻射）。既然如此，把紅箭頭掰到方向跟黃箭頭相反（使其向上發(fā)展），則更容易區(qū)分。實(shí)驗(yàn)上，完全可以讓粒子在激發(fā)態(tài)的時(shí)候keep going，通過(guò)Excited State Absorption（ESA）來(lái)擦除它。Hell組曾經(jīng)利用ESA實(shí)現(xiàn)了對(duì)摻猛的量子點(diǎn)的超分辨。

STED能級(jí)圖（左）和另一種超分辨的能級(jí)實(shí)現(xiàn)模式

一個(gè)箭頭，扭轉(zhuǎn)乾坤。

回答我們剛開始提出的問(wèn)題本質(zhì)上，這—類的方法都是抑制粒子處于激發(fā)態(tài)的幾率，也就是不讓它在S1態(tài)，不管是在搖籃中扼殺(GSD)，到達(dá)后拉下來(lái)(STED)，還是將其送上西天(ESA)。

利用不同的能級(jí)躍遷模式

能夠?qū)崿F(xiàn)點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的直接調(diào)制

這—方法被Stefan Hell稱為RESOLF(Reversible Saturable/Switchable Optical Transitions)可逆飽和/開關(guān)光躍遷。我們講到的STED/GSD/ESA都可以統(tǒng)—地概括在它下面。

SIM

SIM全名StructuredIllumination Microscopy，結(jié)構(gòu)光照明顯微。在介紹SIM之前，可以給大家看—張非常典型的照片。

在椅子背上，能看到不規(guī)則的條紋。這種條紋，如果把圖片放大，可以看到是由椅子前后的網(wǎng)狀織物疊加而成。在科學(xué)上，大家將其稱為莫爾條紋。

由于織物的網(wǎng)格比較密不容易被看到(頻率高)，而莫爾條紋比較粗容易被看到(頻率低)。因此如果知道B的結(jié)構(gòu)，和A+B所疊加的莫爾條紋，將不能探測(cè)的高頻轉(zhuǎn)化為能探測(cè)的低頻，就能夠反推出A所攜帶的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。這就是SIM的原理。如下圖所示。

莫爾條紋示意圖

當(dāng)把這幅圖縮小時(shí)，a和b的條紋不可見，但是c圖中的莫爾條紋仍能夠清楚地看到。

SIM是通過(guò)給照明光一個(gè)調(diào)制實(shí)現(xiàn)分辨率提升，能提升多少？光學(xué)衍射極限的2倍。如果將SIM的結(jié)構(gòu)調(diào)制通過(guò)共軛放在接收端，則SIM是—個(gè)—維調(diào)制。進(jìn)—步地，通過(guò)從多個(gè)角度進(jìn)行—維限制，可以最終得到二維的分辨率提升。目前，比較流行的是每隔120度進(jìn)行—次調(diào)制。

共聚焦成像和SIM成像對(duì)比

如果想進(jìn)—步提升分辨率，則需要更細(xì)的線條。用光學(xué)一次成像，所能得到的細(xì)線的粗細(xì)是受衍射極限限制的。解決方法是通過(guò)某—類的飽和機(jī)制，形成更細(xì)的線，再加上SIM提升的2倍，就能夠?qū)崿F(xiàn)完全突破衍射極限的限制了。

上述我們講的都是如何借助有意識(shí)的對(duì)激發(fā)光或者熒光進(jìn)行調(diào)制，來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨。這些方法從原理上，不需要熒光分子具有什么特性。那么如果化學(xué)家賦予熒光分子以特性呢？或許將誕生新的不可思議。

STORM

《西游記》中真假美猴王的故事，大家都耳熟能詳。美國(guó)科學(xué)院院士、哈佛大學(xué)華人教授莊小威從吳承恩寫此段故事的“色即是空”中獲得靈感，讓西方科技世界看到了東方哲學(xué)之美。

如何實(shí)現(xiàn)從“色即是空”來(lái)慧眼分辨？

當(dāng)兩個(gè)發(fā)光團(tuán)太接近的時(shí)候，傳統(tǒng)分辨率不能分辨。莊小威的想法就是，如果能夠用兩種顏色的光，一束(633 nm)管死，通過(guò)光漂白讓大部分粒子激發(fā)過(guò)度到達(dá)暗態(tài)（死了），另一束(532 nm)管活，通過(guò)激活，就像靈芝草似的，讓極個(gè)別死去的粒子再活過(guò)來(lái)。由于活著的是極少數(shù)。這樣，亮起來(lái)粒子周邊都是不發(fā)光的，就可以很容易地把它定位出來(lái)，再把它激發(fā)、打死，救活另外一些，如此往復(fù)。

通過(guò)“你死我活”的策略，對(duì)粒子的定位逐—擊破。就如一場(chǎng)初春的小雨落在池塘，只要雨小，就能通過(guò)漣漪跟蹤到每滴雨灑落的位置。這就是STORM，全稱是Stochastic Optical Reconstruction Microscopy。

為什么莊小威會(huì)發(fā)現(xiàn)Nature Methods？選對(duì)了合適的問(wèn)題當(dāng)然是一方面，另一方面是，她發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的Cy3-Cy5染料對(duì)，發(fā)不同顏色的光，這一對(duì)熒光團(tuán)過(guò)去被用在熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET成像研究中。小威在進(jìn)行感冒病毒的研究中偶然發(fā)現(xiàn)，這一對(duì)可愛的蛋白能夠像開關(guān)一樣，通過(guò)光控制它們或者發(fā)熒光，或者不發(fā)熒光。

有了開關(guān)，就實(shí)現(xiàn)了超分辨。開關(guān)就是二進(jìn)制，就是陰陽(yáng)，就是太極，就是八卦，就是萬(wàn)物。

PALM

與STORM原理類似，單分子定位超分辨技術(shù)領(lǐng)域還有個(gè)幾乎在同一時(shí)間被發(fā)明的技術(shù)：PLAM。

作為高富帥的Eric Betzig，因?yàn)閷?duì)顯微技術(shù)的念念不忘，放棄了管理家族企業(yè)，與好友Harald Hess一起屢敗屢戰(zhàn)15年，希望能用生物學(xué)知識(shí)獲取高分辨率的顯微圖像。直到2002年，當(dāng)Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson發(fā)明的光敏綠色熒光蛋白(photo-activatable green fluorescent protein)后，他們知道他們已經(jīng)找到了解決問(wèn)題的關(guān)鍵所在：開關(guān)-定位。

2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott Schwartz小組在Science上發(fā)表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚地看到細(xì)胞黏著斑和特定細(xì)胞器內(nèi)的蛋白質(zhì)。

PLAM用于觀察溶酶體跨膜蛋白

與《圣經(jīng)-新約》里門徒從手掌的釘痕認(rèn)出變了身的耶穌一樣，PALM也正是因?yàn)樵谑终疲ㄑ苌錁O限分辨決定的區(qū)域內(nèi)）范圍內(nèi)通過(guò)蛋白質(zhì)開-關(guān)的效應(yīng)，因?yàn)橹挥幸粋€(gè)釘痕，所以就能夠通過(guò)定位將其分辨出來(lái)了。

SDOM

我們中學(xué)物理就做過(guò)將兩個(gè)偏振片不同夾角放置來(lái)觀察透射光光強(qiáng)的變化的實(shí)驗(yàn)。固定其中一個(gè)偏振片，旋轉(zhuǎn)另一個(gè)偏振片我們會(huì)觀察到光強(qiáng)明暗相間的變化。生活中偏振相關(guān)元件也無(wú)處不在，太陽(yáng)鏡，3D眼鏡……相信大家對(duì)偏振一點(diǎn)都不陌生，但是它與超分辨有什么關(guān)系呢？

我們前面講述了STED是在空間維度將不同的點(diǎn)區(qū)分開，PLAM/STORM是在時(shí)間維度將不同的點(diǎn)分開。這也就啟發(fā)科學(xué)家們?nèi)ニ伎寄芊裨谄渌S度將距離很近的兩個(gè)點(diǎn)分開？2016年10月，北京大學(xué)席鵬課題組提出SDOM（Super-resolution Dipole Orientation Mapping microscopy）技術(shù)，將兩個(gè)距離很近的點(diǎn)在偏振維度分開從而實(shí)現(xiàn)了超分辨，該工作也得到了Nature Methods的亮點(diǎn)報(bào)道。

SDOM工作原理圖

偏振熒光顯微主要分兩種：偏振激發(fā)（通常通過(guò)旋轉(zhuǎn)半波片來(lái)實(shí)現(xiàn)）和偏振探測(cè)（通常使用偏振分光棱鏡來(lái)實(shí)現(xiàn)）。不改變?cè)到y(tǒng)光路，僅需在激發(fā)或者探測(cè)光路中添加些許元件就可以很容易地將偏振與現(xiàn)有的成像系統(tǒng)（包括confocal，two-photon，STORM，SIM等）結(jié)合起來(lái)，因此偏振超分辨近兩年來(lái)也得到了飛速的發(fā)展和重視。

偏振除了可以帶來(lái)超分辨之外，席鵬課題組還利用偏振實(shí)現(xiàn)了偶極子取向信息的探測(cè)，豐富了生物學(xué)家解決問(wèn)題的思路和視角。

反觀超分辨技術(shù)：

STED：通過(guò)區(qū)分—個(gè)點(diǎn)的自發(fā)輻射(on)和受激輻射(off)實(shí)現(xiàn)超分辨；

SIM：通過(guò)調(diào)制一系列平行的ON-OFF實(shí)現(xiàn)超分辨；

PALM/STORM：隨機(jī)地調(diào)制點(diǎn)的ON-OFF實(shí)現(xiàn)超分辨。

細(xì)看的話：

STED和SIM均是形成一個(gè)結(jié)構(gòu)性的光調(diào)制來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨，不依賴于特定的熒光染料；

PALM/STORM則是通過(guò)特定染料的性質(zhì)，通過(guò)光控制來(lái)實(shí)現(xiàn)ON-OFF；

SDOM則是通過(guò)對(duì)染料的偏振調(diào)制，實(shí)現(xiàn)的一種新型超分辨技術(shù)。