在化學分析領域，液相色譜(Liquid Chromatography，簡稱LC)是一種高效能的分離和分析技術，是用來分析化學并配合適當的檢測手段。它利用液體作為流動相，在固定相和流動相之間對樣品進行分離，廣泛應用于生物、醫藥、環境、食品等多個領域。

那么，做液相分析試驗時，哪些操作容易被忽略？下面，我們就來看一看。

1、流動相不過濾

因為塵埃或其它任何雜質微粒都會磨損柱塞、密封環、缸體和單向閥，因此應預先除去流動相中的任何固體微粒。

流動相最好在玻璃容器內蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用Millipore濾膜(0.2μm或0.45μm)等濾器。泵的入口都應連接砂濾棒(或片)。輸液泵的濾器應經常清洗或更換。

2、使用后不及時清洗泵

流動相不應含有任何腐蝕性物質，含有緩沖液的流動相不應保留在泵內，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內，由于蒸發或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環和柱塞等。

因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護的溶劑(對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇-水)。

3、流動相走空

泵工作時要留心防止溶劑瓶內的流動相被用完，否則空泵運轉也會磨損柱塞、缸體或密封環，最終產生漏液。

4、沒有流動相流出，又無壓力指示怎么辦？

可能是泵內有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量(如5ml/min)下運轉，將氣泡排盡，也可用一個50ml針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環磨損，需更換。

5、壓力和流量不穩了？

原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內超聲清洗。有時可能是砂濾棒內有氣泡，或被鹽的微細晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?。

這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內超聲除氣泡，或將砂濾棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)內迅速除去微生物，或將鹽溶解，再立即清洗。

6、壓力為啥過高或過低？

可能是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應逐段進行。在進行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此帶來一些特殊問題，必須充分重視。

備注：在液相色譜中對組分復雜的樣品采用梯度洗脫的方法。在同一個分析周期中，按一定程序不斷改變流動相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個復雜樣品中的性質差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達到良好的分離目的。

梯度洗脫的優點：

? 縮短分析周期；

? 提高分離能力；

? 峰型得到改善，很少拖尾；

? 增加靈敏度，但有時引起基線漂移。

7、梯度洗脫的流動相選擇不當

要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當有機溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。

8、忽略的空白梯度洗脫

梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辨認溶劑雜質峰，因為弱溶劑中的雜質富集在色譜柱頭后會被強溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產生氣泡。

9、忽略了溶劑混合所帶來的粘度變化

混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因而在梯度洗脫時常出現壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。

10、關于六通閥的正確使用和維護

①樣品溶液進樣前必須用0.45μm濾膜過濾，以減少微粒對進樣閥的磨損。

②轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置，否則流動相受阻，使泵內壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉到進樣位時，過高的壓力將使柱頭損壞。

③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進樣閥中，每次分析結束后應沖洗進樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。

11、關于色譜柱的使用和維護

色譜柱的正確使用和維護十分重要，稍有不慎就會降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護色譜柱。

12、調節流速太快

避免壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內填料，因此在調節流速時應該緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩(如前所述)。

13、反沖色譜柱

一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會迅速降低柱效。

14、預柱和保護柱

選擇使用適宜的流動相(尤其是pH)，以避免固定相被破壞。有時可以在進樣器前面連接預柱，分析柱是鍵合硅膠時，預柱為硅膠，可使流動相在進入分析柱之前預先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質被溶解。

需要注意的是避免將基質復雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內，需要對樣品進行預處理或者在進樣器和色譜柱之間連接一保護柱。保護柱一般是填有相似固定相的短柱。保護柱可以而且應該經常更換。

總之，液相色譜作為一種重要的分離和分析技術，在多個領域都有著廣泛的應用。隨著科技的不斷發展，液相色譜技術也在不斷更新和完善，為科學研究和工業生產提供了有力支持。